呼寧散對雞肺源大腸桿菌生長曲線、細胞壁的影響及抑制效果——討論、結論
3討論
雞呼吸道疾病綜合征的病原體復雜多樣，大腸桿菌是該病最常見的細菌性病原體之一。雞大腸桿菌感染在中獸醫上屬濕熱證，其感染所致的雞呼吸道疾病綜合征在中獸醫被歸類于“上感”癥狀的范疇，治療時應著重于瀉肺平喘、恢復肺氣的暢達與宣降、消炎抑菌、清熱解毒及增強免疫力等。因此，本試驗在該病的中獸醫病因分析基礎上，根據“辨證施治”基本原則，篩選出桑白皮、黃芩、蒲公英、甘草等10味中草藥，按照“君臣佐使”配伍原則進行了合理組方。便攜的中藥劑型在當前中獸藥市場更受消費者青睞，本研究將方中藥材依次進行浸泡、煎煮得到湯劑，再通過濃縮、凍干、粉碎后得到呼寧散，在不改變藥效的前提下，改變了湯劑的物理性狀，可延長中藥的保質期，且方便攜帶、保存和使用。
抑菌試驗結果是抗菌藥物最基本的藥效學數據，常用的方法有紙片擴散法、牛津杯法、二倍稀釋法及TTC法等。在抑菌試驗中MIC和MBC是重要指標，能抑制試驗菌生長的最低藥物稀釋度為該藥的MIC，能夠殺滅試驗菌的最低藥物稀釋度為該藥的MBC。同時細菌生長情況可以通過繪制生長曲線進行了解。高瑞芳等通過測定細菌生長曲線檢測到香青蘭提取物對大腸桿菌具有抑菌活性。本試驗選用的牛津杯法結果顯示雞肺源大腸桿菌對呼寧散中度敏感，TTC法測得呼寧散對雞肺源大腸桿菌的MIC為250 mg·mL-1，MBC為500 mg·mL-1，且細菌生長曲線結果也顯示呼寧散在0~24 h內均可抑制該菌株的生長，表明呼寧散對雞肺源大腸桿菌具有顯著的抑制效果。
細菌的細胞膜和細胞壁之間存在AKP，當細胞壁受到破壞后，AKP會由胞內泄漏到胞外，可以通過檢測胞外AKP含量(或活性)以確定細胞壁的完整性。正常情況下蛋白質、核酸等大分子無法通過細胞膜屏障，當細胞膜通透性受到破壞時，胞內物質外溢會導致胞外蛋白、核酸濃度升高，不利于細菌成長。劉琳等通過電導率檢測儀檢測到石榴皮水提物作用于大腸桿菌3 h后，菌液中AKP含量顯著增加，表明石榴皮水提物能破壞大腸桿菌細胞壁。Wang等采用酶標儀檢測大腸桿菌核酸的外滲水平，結果顯示細菌紫外吸收率顯著增加，證明野胡麻破壞了大腸桿菌的細胞膜完整性。本試驗通過檢測雞肺源大腸桿菌培養液中AKP活性、可溶性蛋白及核酸含量，結果發現呼寧散作用于細菌12 h時，1/2 MIC組和MIC組培養液中AKP、可溶性蛋白及核酸含量均顯著增加，表明呼寧散可破壞雞肺源大腸桿菌的細胞壁和細胞膜而發揮抑菌作用。
LPS是革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，也是病原菌最為重要的模式分子，可誘導嚴重的炎癥反應，激活細胞產生多種炎癥因子，從而引起一系列的病變，常用來代替大腸桿菌誘導炎癥動物或細胞模型。DF-1細胞為可傳代的雞成纖維細胞系常用以研究禽類病原體對細胞的損傷，因此本試驗選取LPS誘導的DF-1細胞模型來探究呼寧散的體外抗炎和抗氧化作用。CCK-8溶液中的WST-8在電子耦合試劑存在時，可被細胞中的脫氫酶還原為黃色，顏色的深淺和細胞數目呈線性關系，因此本試驗利用這一特性進行細胞增殖和細胞毒性測定，確定了呼寧散低、中、高劑量組的給藥濃度分別為1.5、2、2.5 mg·mL-1，LPS誘導DF-1細胞損傷的建模濃度為40 mg·mL-1，為后續體外試驗奠定了基礎。
TLR4/NF-κB信號通路在炎癥反應過程中起著關鍵性作用。LPS與TLR4配體結合激活NF-κB信號通路，導致細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等分泌，引起機體炎癥反應。IL-1β大量產生于炎癥初期，促進炎癥反應。IL-6是促炎因子，能與靶細胞表面IL-6受體結合成復合物，調控炎癥細胞因子的表達。IL-8也是常見的促炎因子，參與炎癥感染時各種細胞的相互作用。大量研究表明，中藥能夠通過抑制TLR4/NF-κB通路中的炎癥因子從而緩解炎癥狀態。本試驗通過ELISA法測定細胞培養上清中IL-1β、IL-6和IL-8的含量，進一步地通過Western blot法測定TLR4/NF-κB通路關鍵蛋白TLR4、NF-κB p65的表達量，結果證實呼寧散可通過調控TLR4/NF-κB信號通路來抑制炎癥因子的過度分泌，從而減輕LPS誘導的DF-1細胞炎癥反應。
體內感染通常會產生大量的超氧陰離子，氧化應激與炎癥反應關系密切。氧化應激是指細胞內氧化和抗氧化系統的失衡，導致平衡傾向于過氧化狀態。研究表明，LPS可通過激活促炎細胞因子產生大量的ROS，進而導致細胞出現氧化應激。當ROS過量時，多余的ROS會攻擊體內組織，導致細胞的損傷和衰老。MDA是膜脂過氧化重要的產物之一，它的產生還能加劇膜的損傷，是評價氧化應激的重要指標。SOD是機體內天然自由基消除劑，能催化機體內超氧自由基發生歧化反應，是檢測抗氧化能力的指標之一。GSH是體內重要的抗氧化劑，可以將有毒物質轉化為無害物質，排泄出體外，反映了組織抵抗氧化損傷的能力。Wang等研究表明，LPS可通過誘導氧化應激引起雞肝臟細胞變性和壞死，增加體內ROS和MDA的產生，進而導致肝臟發生氧化損傷。本試驗通過相關試劑盒檢測ROS、MDA、SOD、GSH含量，結果發現呼寧散可降低DF-1細胞中氧化應激標志物ROS和MDA的含量，提高抗氧化物SOD和GSH的水平。Keap1/Nrf2通路是抵御氧化應激的主要防御機制，Nrf2是一種關鍵轉錄因子，能夠通過調控下游抗氧化基因的轉錄誘導抗氧化酶的生成，從而調節細胞或機體的抗氧化能力。正常情況下Nrf2與Keap1相結合，氧化應激狀態下Nrf2與Keap1解離而活化，進一步激活下游抗氧化基因和細胞保護基因的表達，主要包括HO-1、NQO1、GSH等。本試驗進一步通過Western blot法測定了Keap1/Nrf2信號通路關鍵蛋白Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1表達量，結果發現呼寧散可明顯降低Keap1蛋白表達量，上調Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達量，表明呼寧散可通過調控Keap1/Nrf2信號通路提高DF-1細胞的抗氧化能力，從而有效緩解LPS所致的氧化損傷。
4結論
呼寧散對雞肺源大腸桿菌具有良好的抑菌活性，并且可通過調控LPS誘導的DF-1細胞TLR4/NF-κB、Keap1/Nrf2信號通路發揮抗炎、抗氧化能力，為臨床用于防治雞肺源大腸桿菌及雞呼吸道疾病綜合征藥物的研發提供理論依據。