呼寧散對雞肺源大腸桿菌生長曲線、細胞壁的影響及抑制效果——材料與方法
1材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗菌株
雞肺源大腸桿菌分離自雞呼吸道疾病綜合征患病肉雞肺臟，于延邊大學獸醫藥理學實驗室保存。
1.1.2試驗細胞
DF-1細胞購自上海富衡生物科技有限公司。
1.1.3試驗藥品
地骨皮、桑白皮、黃芩、黨參、桔梗、茯苓、知母、玄參、蒲公英、甘草10味中藥購自延吉市同仁堂大藥房。
1.1.4主要試劑及儀器
堿性磷酸酶(AKP)測定試劑盒(A059-2-2)、活性氧(ROS)測定試劑盒(E004-1-1)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(A003-1-2)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(A001-3-2)、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(A006-2-1)均購自南京建成生物工程研究所；脂多糖(LPS)購自Sigma公司；胎牛血清購自以色列BI公司；DMEM高糖培養基購自Gibco公司；青霉素、鏈霉素、PBS緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒(PC0020)均購自北京索萊寶生物科技有限公司；白細胞介素1β(IL-1β)檢測試劑盒(MM-36910O1)、IL-6檢測試劑盒(MM-0521O1)、IL-8檢測試劑盒(MM-0768O1)均購自江蘇酶免實業有限公司；一抗：兔TLR4(bs-20379R)、NF-κB p65(bs-0465R)、Keap1(bs-4900R)、Nrf2(bs-1074R)、NQO1(bs-2184R)、HO-1(bs-23397R)、GAPDH(bs-41373R)以及二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(bs-40295G-HRP)均購自北京博奧森生物技術有限公司；T25培養瓶購自廣州清風生化科技有限公司；CCK-8檢測試劑盒(C0037)購自上海碧云天生物科技有限公司。37℃恒溫箱購自Thermo公司；細胞培養箱C150型購自Binder公司；iMark酶標儀、電泳儀、PCR儀均購自Bio-Rad公司；臺式高速離心機購自Sigma公司。
1.2試驗方法
1.2.1中藥復方呼寧散的制備
將地骨皮、桑白皮、黃芩、黨參、桔梗、茯苓、知母、玄參、蒲公英、甘草按特定比例(桑白皮、黃芩、蒲公英、甘草質量份數5∶4∶3∶3，其他藥味因專利保護未予公布)準確稱量，加適量水浸泡30 min，煎煮30 min，濾出藥液，藥渣再煎煮30 min，合并藥液，55℃旋轉蒸發濃縮，真空冷凍干燥制成凍干粉，即為呼寧散。小量分裝后置于-20℃保存。使用時稱取適量凍干粉，按照試驗所需濃度進行配制。
1.2.2牛津杯藥敏試驗
采用牛津杯法測定抑菌圈直徑。將制備好的雞肺源大腸桿菌菌液稀釋至1×105 cfu·mL-1，涂布于LB瓊脂平板。以慶大霉素藥敏紙片和無菌水為對照，無菌操作向牛津杯中注入0.1 mL(1 g·mL-1)呼寧散，37℃培養24 h，測抑菌圈直徑。判定標準：抑菌圈直徑≥20 mm為高度敏感，10~19 mm為中度敏感，＜10 mm或無抑菌圈為不敏感。
1.2.3 MIC和MBC的測定
采用2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定呼寧散對雞肺源大腸桿菌的MIC。從混合液澄清的各孔依次吸取100μL培養物接種到固體培養基上培養，以菌落數小于5個視為無菌生長，以無菌生長的藥物最低濃度作為呼寧散對雞肺源大腸桿菌的MBC。
1.2.4細菌生長曲線的測定
將雞肺源大腸桿菌懸液調整至1×105 CFU·mL-1，加入呼寧散溶液，使其終濃度為和1/2 MIC和MIC，37℃培養，630 nm處測定吸光值，根據培養時間和吸光值繪制細菌生長曲線。
1.2.5菌液中AKP含量的測定
按“1.2.4”進行分組，37℃、180 r·min-1條件下培養12 h，每隔6 h取等量菌液，4 500 r·min-1離心15 min，取上清，根據AKP檢測試劑盒說明書測定菌液上清中AKP的含量。
1.2.6菌液中可溶性蛋白和核酸含量的測定
按“1.2.4”進行分組，37℃、180 r·min-1條件下培養12 h，每隔6 h取等量菌液，4 500 r·min-1離心15 min，取上清：(1)檢測培養液中的可溶性蛋白含量變化，按BCA蛋白定量測定方法測定蛋白濃度；(2)檢測培養液中的核酸含量變化，待測上清液于260 nm處測定吸光值。
1.2.7 LPS及呼寧散對DF-1細胞的毒性試驗
將生長狀態良好的DF-1細胞調整至濃度為5×104個·mL-1,以每孔100μL接種于96孔板，培養24 h，PBS洗滌細胞3次。(1)加入含有0、10、20、30、40μg·mL-1 LPS的DMEM培養基，繼續培養24 h。(2)在另一塊含有細胞的96孔中加入含有0、1、1.5、2、2.5、3、4 mg·mL-1呼寧散的DMEM完全培養基，繼續培養24 h。LPS及呼寧散處理結束后每孔加入10μL的CCK-8溶液，繼續培養1.5 h，用酶標儀檢測450 nm處OD值。
1.2.8細胞試驗分組與給藥
將生長狀態良好的DF-1細胞調整至濃度為5×104個·mL-1，分為空白組、LPS組、呼寧散劑量組(低、中、高)。空白組：DF-1細胞培養24 h貼壁后，后續每24 h更換一次完全培養基；LPS組：DF-1細胞培養24 h貼壁后，先更換完全培養基培養24 h，再換成含有40μg·mL-1 LPS的完全培養基；呼寧散組：DF-1細胞培養24 h貼壁后，分別換成含有1.5、2、2.5 mg·mL-1呼寧散的完全培養基預處理1 h，之后加40μg·mL-1 LPS的完全培養基。
1.2.9 ELISA法測定相關炎癥因子含量
各組細胞給藥及培養24 h后，收集上清培養液，根據相應ELISA試劑盒說明書測定上清液中的IL-1β、IL-6、IL-8含量。
1.2.10氧化應激指標和抗氧化物含量的測定
收集上述各試驗組DF-1細胞，提取細胞總蛋白，按照ROS、MDA、SOD、GSH試劑盒說明書指導測定各指標。
1.2.11 Western blot法測定細胞TLR4/NF-κB炎癥通路及Keap1/Nrf2氧化通路關鍵蛋白的表達
各組細胞給藥及培養24 h后，RIPA法提取細胞總蛋白及核蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白統一定量后進行SDS-PAGE電泳，采用濕轉法將目的蛋白轉移至PVDF膜。TBST洗膜，5%脫脂乳中封閉1 h。TBST洗膜，分別加入一抗兔抗TLR4、NF-κB p65、Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1及內參GAPDH抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜，加入二抗羊抗兔IgG H&L(HRP)抗體室溫孵育1 h。TBST洗膜，ECL顯色，拍照，Image J軟件進行灰度分析。
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