五種常用抗真菌藥物對198株白色念珠菌最低抑菌濃度【藥敏試驗】
白色念珠菌(Candida albicans，CA)是最常見的一種條件致病性真菌，大多發生在機體免疫力低下或菌群失調時，如腫瘤、慢性消耗性疾病、長期大量使用廣譜抗生素、免疫抑制劑和激素等過程中易發生感染白色念珠菌，深部白色念珠菌感染的病死率高達68.90%。用常規培養的方法繁瑣且費時，漏檢率也很高。因此，快速、準確地從臨床標本中直接檢出白色念珠菌對于疾病的早期診斷和治療以及對該病的流行病學調查亦有十分重要的意義。我們從2005年到2008年在臨床病例中分離了198株白色念珠菌，采用聚合酶鏈反應(nested PCR，nPCR)從臨床標本中直接檢測白色念珠菌，取得了良好的效果。目前，白色念珠菌對臨床上常用的幾種抗真菌藥物的耐藥率已達到相當高的比例，這給臨床上抗真菌感染治療帶來一定困難。為了解白色念珠菌對抗真菌藥物的敏感性，以便為臨床正確選擇抗真菌藥物和有效控制白色念珠菌引起的感染提供依據，我們測定了五種常用抗真菌藥物對198株白色念珠菌最低抑菌濃度(MIC)，現報告如下。
1材料與方法
1.1臨床分離菌株來源白色念珠菌標準菌株CA16為本實驗室保存，臨床分離菌株共339份，包括痰液109份，尿液85份，陰道拭子78份，咽拭子20份，創面分泌物19份，腹水8份，胸水6份，血液9份，腦脊液5份。以上標本均來自長春中醫藥大學附屬醫院。
1.2模板液制備挑取純菌落混勻后置于55℃1 h，煮沸5 min，取出后1000 rpm離心30 s，上清即為擴增的模板液。臨床標本處理:尿液、腦脊液、胸水、腹水等液體標本可直接取1ml備用，抗凝的血液直接吸取1 ml備用，拭子類標本應先置拭子于1-2 ml生理鹽水中充分洗脫后，吸取1 ml備用。
1.3引物設計白色念珠菌種特異性引物系從內轉錄2區(internaltranscribedspacer-2，ITS-2)中選擇，CAF:5'-AACTTGCTTTGGCGGTGGGG-3';CAR:5'-TGGACGTTACCGCCGCAAGCC-3'，目標堿基長度為386 bp，引物由大連寶生物合成。
1.4 PCR檢測
用引物CAF和CAR，以各菌株為模板，反應體系為:10×ExTaq Buffer，2.5μl;dNTP(10 mM)，0.5μl;CAF/CAR，各0.5μl;ExTaq酶，0.25μl;Template，1μl;ddH2O，19.75μl;總體積，25μl。反應條件為:94℃預變性4 min，然后進入循環，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環，最后72℃延伸5 min，1%瓊脂糖凝膠電泳。
1.5測OD值、活菌計數
在超凈工作臺內用接種環挑取單菌落接種于5ml改良沙堡氏液體培養基的試管中，置30℃恒溫搖床振蕩培養過夜。將培養過夜的菌液用血細胞計數板計數并用滅菌改良沙堡氏液體培養基調整菌液濃度為5×104CUF/ml。
用移液器分別吸取上述10μl接種菌液加入300 ml改良沙堡氏液體培養基的三角燒瓶中，置30℃恒溫搖床振蕩培養，從培養0 h時起及以后，每隔2 h取菌測OD530值。
1.6藥敏試驗
取150μl菌液加入藥敏培養基，混勻后取150μl加入藥敏試驗孔，30℃濕盒培養20 h-24 h后加顯色劑，繼續培養12 h-24 h后讀取藥敏結果。
2結果
2.1臨床標本白色念珠菌PCR檢測
339份臨床標本包括痰、尿、咽拭子、血液等，PCR檢出結果顯示從痰標本中分離出的白色念珠菌最多77株占70.2%，其次是陰道拭子53株占67.4%，具體分布情況見表1，部分標本的PCR電泳圖見圖1，擴增出目的片段大小386 bp，與預期片段大小一致，其中5號泳帶為陽性對照，6號泳帶為陰性對照，其他3份標本均為白色念珠菌。
表1臨床標本白色念珠菌PCR檢測結果
2.2白色念珠菌生長速率實驗
在培養條件不變的情況下，每2 h取樣測定其在530 nm處的OD值，然后以時間為橫坐標，OD的對數為縱坐標可形成一條生長曲線。白色念珠菌生長的遲緩期為0-16 h，對數生長期為16-30 h，之后進入穩定期和衰退期。生長曲線如圖2:
圖1 PCR電泳圖
2.3白色念珠菌藥敏試驗
對198株白色念珠菌進行藥物敏感試驗，藥物敏感性由高到低為:氟胞嘧啶(92%)、兩性霉素(87.9%)、制霉素(85.4%)、酮康唑(29.8%)、咪康唑(18.7%)、伊曲康唑(14.1%)、氟康唑(5%);耐藥性由低到高為:氟胞嘧啶(2.5%)、制霉素(5%)、兩性霉素(8%)、酮康唑(8.6%)、咪康唑(39.9%)、伊曲康唑(45%)、氟康唑(75.8%)，見表2。
圖2白色念珠菌生長曲線
表2 198株白色念珠菌藥敏表
3討論
白色念珠菌是引起臨床上深部真菌感染常見的病原菌，80%以上AIDS患者受真菌尤其是白念珠菌感染比較常見，深部真菌感染已成為許多疾病的主要死亡原因之一。所以從基因水平上檢測白色念珠菌是近年研究的熱門，基因檢測方法具有快速、高特異性、高敏感性等優點，相信基因檢測技術一定能廣泛用于臨床。
本實驗中我們用PCR技術對臨床標本339份白色念珠菌進行檢測，檢出白色念珠菌198株，檢出率為54%。檢出率高的原因是由于這些患者年老、體弱、病重、抗生素大量使用，使機體免疫力下降，導致體內微生態平衡紊亂，從而使條件致病性真菌特別是白色念珠菌大量繁殖。有學者認為抗生素是直接促進真菌生長和毒性作用發揮的主要因子。抗生素的不合理應用是促使真菌生長的重要因素，因此合理應用抗生素十分關鍵。從統計結果可以看出，白色念珠菌感染多見于呼吸道和泌尿道，它在痰標本檢出率最高，檢出率為70.2%;其次是尿液標本，檢出率為67.4%。白色念珠菌作為正常菌群的一部分，在人的呼吸道和腸道少量存在，當人的免疫防疫系統由于疾病或呼吸機、氣管插管、留置導尿管等醫源性因素而損害，引起繼發性感染，從而引起痰檢率或尿檢率白色念珠菌的升高。
細菌的生長指細菌有規律的增長，包括細菌體積的增大，代謝功能的完善及細菌數量的增多。不同的菌種有其各自不同生長規律。本實驗顯示白色念珠菌生長的遲緩期為0-16h，對數生長期為16-30 h，之后進入穩定期和衰退期，因此在對白色念珠菌進行研究時，我們一般選取培養24-28 h的培養物進行研究。
白色念珠菌在女性陰道中的發病率較高，隨著抗生素、免疫抑制劑及各種激素的廣泛使用，各種細菌的耐藥性逐年升高，而真菌的藥敏情況亦如此。為了給臨床提供治療白色念珠菌的有效途徑，我們對2008年我院分離的198株白色念珠菌進行藥敏分析，結果顯示:氟胞嘧啶、兩性霉素、制霉素的敏感率較高，與有關文獻報道大多耐藥性一致，而敏感性有差異，這可能跟不同地區的用藥習慣有關。酮康唑、咪康唑、伊曲康唑、氟康唑作為廣譜抗真菌藥，應用廣泛，導致中度敏感和耐藥性增高。因此，臨床在治療白色念珠菌時，特別反復感染白色念珠菌者，應做藥敏試驗，避免藥物濫用，以達到最佳的治療效果。
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