茯磚茶中金花菌菌落標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)方法優(yōu)化條件【試驗(yàn)】（二）
2.1.2無菌稀釋液濃度對金花菌菌落總數(shù)的影響
無菌稀釋液濃度對金花菌菌落總數(shù)的影響見圖2。
圖2無菌稀釋液對金花菌菌落總數(shù)的影響
由圖2可知，磷酸緩沖溶液對金花菌孢子釋放作用不明顯，數(shù)量僅為（18.0±1.0）×105CFU/g。當(dāng)稀釋液中NaCl濃度為0.85%時(shí)，金花菌菌落總數(shù)最多，為（35.0±0.8）×105CFU/g。當(dāng)滲透壓過低時(shí)，過多的水分進(jìn)入孢子，會使孢子膨脹或破裂而失活；當(dāng)滲透壓過高時(shí)，孢子失水收縮，細(xì)胞結(jié)構(gòu)容易被破壞而失活。因此，無菌稀釋液以0.85%NaCl溶液為宜。
2.1.3振搖時(shí)間對金花菌菌落總數(shù)的影響
振搖時(shí)間對金花菌菌落總數(shù)的影響見圖3。
圖3振搖時(shí)間對金花菌菌落總數(shù)的影響
金花菌菌落總數(shù)隨振搖時(shí)間的延長而增加，表明物理振搖對金花菌子囊果破壁也有一定影響。當(dāng)振搖時(shí)間為50 min時(shí)，金花菌菌落總數(shù)為（36.9±0.8）×105CFU/g；振搖50 min后金花菌菌落總數(shù)趨于平緩，因此振搖時(shí)間選擇50 min。
2.2響應(yīng)面結(jié)果與分析
2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
以篩子目數(shù)、無菌稀釋液濃度、振搖時(shí)間為自變量，以金花菌菌落總數(shù)為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。
表2響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果
2.2.2模型建立與回歸方程分析
采用Design-Expert.V8.0.6對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性擬合，得到以金花菌菌落總數(shù)為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型方程：Y=50.42-046A+0.54B+1.78C+0.65AB-0.075AC+2.63BC-8.94A2-10.88B2-14.41C2。對模型方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，方差分析結(jié)果見表3。
表3平板計(jì)數(shù)法回歸方程方差分析表
由表3可知，模型差異性極顯著（P＜0.000 1），說明方程與實(shí)際情況擬合較好，能夠反映金花菌菌落總數(shù)與各因素之間的關(guān)系；失擬項(xiàng)差異不顯著（P＞0.05），說明其他因素對試驗(yàn)影響很小，適用于茯磚茶中金花菌菌落計(jì)數(shù)方法的優(yōu)化。
表3中F值的大小可以判斷各因素對金花菌菌落總數(shù)影響的強(qiáng)弱。各個因素對金花菌菌落總數(shù)影響的程度大小的次序?yàn)楹Y子目數(shù)＞NaCl濃度＞振搖時(shí)間，數(shù)學(xué)模型的結(jié)果表明A、B、C、AB、BC、A2、B2及C2差異性達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），表明各考察因素對金花菌菌落總數(shù)的影響具有交互作用，而不是簡單的線性關(guān)系。可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。其相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9，表明試驗(yàn)所選擇的3個變量對響應(yīng)值的影響已達(dá)99.79%，表示該模型條件能夠很好地反映實(shí)際值。其他影響因素對菌落總數(shù)的影響可忽略不計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)得到的最優(yōu)處理?xiàng)l件為：篩子目數(shù)79.74目、NaCl濃度0.86%、振蕩時(shí)間50.49 min，模型預(yù)測的最佳菌落數(shù)為50.49×105CFU/g。
2.2.3各因素之間的響應(yīng)面結(jié)果分析
各因素交互作用對金花菌菌落總數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線圖見圖4。
圖4各因素交互作用對金花菌菌落總數(shù)影響的響應(yīng)面和等高線圖
響應(yīng)面三維圖中曲面的陡峭程度可以表明自變量對金花菌菌落總數(shù)的影響程度，曲面較陡表明影響較大，反之則較小；而等高線圖反映了因素間交互作用的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著。結(jié)合本研究中的二次回歸方程及表3可知，二次項(xiàng)AB、BC具有極顯著的交互作用（P＜0.01），即篩子目數(shù)與NaCl濃度、NaCl濃度與振搖時(shí)間每兩個因素間均具有顯著的交互作用。由圖4可知篩子目數(shù)與NaCl濃度、NaCl濃度與振搖時(shí)間、篩子目數(shù)與振搖時(shí)間對菌落總數(shù)的影響先升高后降低，響應(yīng)值呈拋物線形趨勢，因此回歸方程有極大值。
2.2.4模型的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
為了檢驗(yàn)響應(yīng)面方法的可靠性，本研究按照模型得到的金花菌菌落總數(shù)最佳計(jì)數(shù)條件進(jìn)行試驗(yàn)操作驗(yàn)證，結(jié)合試驗(yàn)的可行性，得到最終優(yōu)化條件為篩子目數(shù)80目、稀釋液為0.85%NaCl溶液、振搖時(shí)間50 min，平行6次試驗(yàn)，得到金花菌菌落總數(shù)為（50.75±1.1）×105CFU/g，與模型預(yù)測的數(shù)值進(jìn)行比較分析，菌落數(shù)的RSD值為1.1%，其RSD值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于3%，因此，可以選擇以上條件作為茯磚茶中金花菌菌落總數(shù)的最佳優(yōu)化參數(shù)。
2.3方法驗(yàn)證
采用上述優(yōu)化方法與國標(biāo)方法進(jìn)行金花菌菌落總數(shù)的對比，結(jié)果見表4。
表4國標(biāo)方法和優(yōu)化方法對不同茯磚茶的計(jì)數(shù)結(jié)果
結(jié)果顯示，優(yōu)化方法得到的金花菌菌落總數(shù)是國標(biāo)方法的5倍左右。
3結(jié)論
目前關(guān)于金花菌菌落計(jì)數(shù)方法及破壁方法的研究較少，本研究在國標(biāo)方法的基礎(chǔ)上對樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，取樣時(shí)將整塊茶磚撬碎混勻，茶樣粉碎過篩80目、稀釋液為0.85%NaCl溶液，振搖時(shí)間50min（轉(zhuǎn)速為200 r/min），該條件下，優(yōu)化方法得到的金花菌菌落總數(shù)均在107CFU/g以上，相比國標(biāo)方法提高了5倍左右，優(yōu)化效果明顯，為確定金花菌標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)方法提供了試驗(yàn)依據(jù)。
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