臨床結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗：分子DST檢測VS表型DST藥敏診斷技術(shù)（二）
2結(jié)果
2.1分子DST檢測與表型DST藥敏檢測結(jié)果分析
2.1.1兩種檢測方法耐藥性檢測結(jié)果一致率1750例標本按流程操作共檢測到結(jié)核分枝桿菌菌株1596例，陽性率為91.20%，非結(jié)核分枝桿菌（NTM）154例（8.80%）。其中快速分子DST檢測出利福平（RFP）耐藥菌株98例，耐藥率為6.14%（98/1596），表型DST藥敏檢測出利福平（RFP）耐藥菌株88例，耐藥率為5.51%（88/1596）;兩種方法均檢出利福平（RFP）敏感1478例，均耐藥64例，共1542例利福平（RFP）檢測結(jié)果一致，一致率為96.62%。快速分子DST檢測出異煙肼（INH）耐藥95例，耐藥率為5.95%（95/1596），表型DST藥敏檢測出異煙肼（INH）91例，耐藥率為5.70%（91/1596），兩種方法異煙肼（INH）均敏感1465例，均耐藥55例，共1520例異煙肼（INH）分子DST檢測與表型DST藥敏檢測結(jié)果一致，一致率為95.24%。見表1。兩種方法共檢測出耐多藥肺結(jié)核（MDR-TB）患者34例，耐多藥率為2.13%（34/1596）。
2.1.2分子檢測與表型藥敏對利福平檢測結(jié)果分析54例患者利福平（RFP）分子DST檢測與表型DST藥敏結(jié)果不同，分子DST檢測利福平（RFP）耐藥而表型DST敏感32例;分子DST檢測利福平（RFP）敏感而表型DST耐藥22例，不一致率為3.38%;利福平分子檢測結(jié)果敏感度為97.88%，特異度為74.42%。見表2。
2.1.3分子檢測與表型藥敏對異煙肼檢測結(jié)果分析76例患者異煙肼（INH）分子DST檢測與表型DST藥敏結(jié)果不同，分子DST檢測異煙肼（INH）耐藥而表型DST敏感40例，分子DST檢測敏感而表型DST耐藥36例，不一致率為4.76%。分子檢測對異煙肼檢測結(jié)果敏感度為97.34%，特異度為60.44%。見表3。
2.2分子檢測基因突變位點與表型藥敏檢測結(jié)果分析
利福平（RFP）耐藥檢測中，快速分子DST檢測ropB基因突變檢出率為94.79%（91/96），表型DST藥敏利福平耐藥檢出率為93.02%（80/86），其中位點531（C-T）、513（C-A）、516（A-T）、516（G-T）突變位點的檢出一致率高（96.56%～100.00%）;而526（A-G）、511（T-C）位點分子檢測出陽性，表型DST藥敏檢測未顯示;533（T-C）、531（C-G）、526（A-T）位點的一致符合率為50.00%、77.78%、66.67%;利福平（RFP）突變位點分子與表型DST藥敏一致率為87.91%（80/91）。
異煙肼（INH）檢測中，快速分子DST檢測katG、inhA基因突變位點的檢出率為95.79%（91/95）;表型藥敏DST異煙肼耐藥檢出率為87.91%（80/91）;其中katG315（G-C）、inhA15（C-T）位點的一致率較高，分別為88.73%、88.24%，但仍然發(fā)現(xiàn)尚有10例不一致;katG 315（G-A）有1例分子與表型DST藥敏結(jié)果不一致。見表4。初始分子檢測與表型藥敏結(jié)果不一致分析思路見圖2。
3討論
2020年全球結(jié)核病報告顯示，2019年，全球有近50萬人罹患利福平耐藥（RR-TB）結(jié)核病，其中78%患有耐多藥（MDR-TB）。隨著分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用，2019年發(fā)現(xiàn)并登記MDR/RR-TB患者較2018年增加了10%，但其治療成功率僅為57%。因此，提高細菌學(xué)確診的結(jié)核病患者比例，擴大細菌學(xué)確診的結(jié)核病患者耐藥檢測比例，提高治愈率，是遏制耐藥結(jié)核病傳播的重要措施。
Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)是以實時熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，ropB基因為靶基因，檢測周期僅2 h，是目前WHO推薦的RFP耐藥的檢測方法。本研究結(jié)果顯示，快速分子檢測ropB基因突變檢出率為94.79%（91/96），與李妍等研究痰標本中Xpert MTB/RIF敏感度高達97.5%、特異度為95%～99%相一致。
基因芯片技術(shù)是將MTB的DNA擴增產(chǎn)物與固定在芯片上的探針雜交、掃描芯片及判讀結(jié)果，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床耐藥性的檢測及基因組的比較分析。楊映暉等研究顯示，基因芯片檢測MDR-TB的敏感度與特異度分別為64.62%和97.75%。本研究結(jié)果顯示，異煙肼（INH）快速分子檢測中，katG、inhA基因突變位點的檢出率為95.79%（91/95），與相關(guān)文獻研究結(jié)果一致。
本研究通過對2017年1月至2020年12月確診的1750例涂陽肺結(jié)核患者呼吸道標本中檢測到的1596例結(jié)核分枝桿菌菌株結(jié)果進行分析，快速分子DST檢測技術(shù)與表型DST藥敏檢測的利福平、異煙肼一致率分別達96.62%、95.24%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。提示在臨床上可通過擴大分子檢測技術(shù)作為初始診斷工具，將所有肺結(jié)核患者的初次痰標本、肺泡灌洗液等呼吸道標本納入分子檢測初始診斷范圍，加大在基層醫(yī)院的推廣應(yīng)用，才能確保所有診斷為耐藥（MR-TB）、耐多藥（MDR/RR-TB）的患者早期納入治療，改變耐藥結(jié)核納入治療率低的現(xiàn)狀。2019年全球納入治療的患者比例僅占估算MDR/RR-TB患者數(shù)的38%。研究發(fā)現(xiàn)，嘉興市的耐多藥率僅為2.13%，低于浙江省耐多藥結(jié)核發(fā)病率，證實了嘉興市擴大分子初始檢測策略遏制耐藥結(jié)核傳播的有效性。
本研究結(jié)果還顯示，雖是同一標本平行檢測，也存在著分子檢測與表型藥敏檢測結(jié)果不一致的現(xiàn)象，尚有54例利福平（3.38%），76例異煙肼（4.76%）檢測結(jié)果不一致，給臨床個體治療方案的選擇帶來困惑，也是現(xiàn)階段耐藥結(jié)核治愈率低的因素之一。WHO報告顯示，2019年全球耐藥結(jié)核病治療成功率僅為57%。因此，需認真查找分子DST檢測與表型DST藥敏檢測結(jié)果不一致的原因，及時分析，調(diào)整每一例耐藥結(jié)核患者的治療方案，盡早盡快實施個體化精準診療策略，才能提升治愈率。
本研究涉及到的54例利福平，76例異煙肼患者，針對兩種檢測結(jié)果不一致的原因分析如下：
①檢測標本是否一致。仔細查找發(fā)現(xiàn)2例患者分子檢測與表型培養(yǎng)的標本不是同一個檢測標本;1例患者標本因條形碼掃碼差錯而出現(xiàn)偏差，予重新留取痰標本進行平行檢測。
②檢測技術(shù)的局限性。Xpert MTB/RIF、基因芯片快速分子檢測可檢測到結(jié)核分枝桿菌的核酸，但無法區(qū)別活菌還是死菌;本研究發(fā)現(xiàn)其中1例分子檢測敏感，表型藥敏顯示耐藥，原因是操作過程中標本處理不充分，氫氧化鈉時間過長，消化過程中發(fā)生了結(jié)核分枝桿菌核酸（RNA）降解。1例肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測陽性，表型培養(yǎng)陰性，查找原因發(fā)現(xiàn)支氣管鏡檢查消毒清洗不徹底有死菌殘留存在，而Xpert MTB/RIF檢測DNA敏感度高所致。另外，還需分析在檢測過程中是否存在分子檢測系統(tǒng)的故障、溫度的錯誤、試劑盒儲存不合理等因素。表型固體培養(yǎng)存在絕對濃度法偏差較大、選取菌落時操作不當?shù)纫蛩?。液體960自動培養(yǎng)時吡嗪酰胺（PZA）藥敏菌株過量，在代謝過程產(chǎn)生大量氨類物質(zhì)，從而使整個液體培養(yǎng)環(huán)境的pH值升高，導(dǎo)致PZA失去殺菌能力而造成假陽性結(jié)果?？赡軐?dǎo)致其藥敏試驗結(jié)果重復(fù)性差，造成PZA分子與表型藥敏結(jié)果不一致。
③不同突變類型與耐藥相關(guān)性。從突變位點分析，發(fā)現(xiàn)1例快速分子檢測利福平（RFP）基因ropB位點526（A-G）突變、3例利福平（RFP）511（T-C）位點分子檢測陽性，而表型藥敏檢測并不耐藥;1例利福平（RFP）基因533（T-C）、2例531（C-G）、1例526（A-T）位點突變不一致，提示基因突變位點不同，與表型藥敏試驗的相關(guān)性也是不同的。郭晶等研究顯示，基因突變在不同年齡組人群中存在一定的差異。個別突變位點還應(yīng)當結(jié)合臨床治療情況進行觀察與分析，不同突變位點應(yīng)當結(jié)合患者的藥敏試驗結(jié)果與整體治療情況進行個體化治療。
④靜默突變。沉默子突變只是改變核苷酸位點而不改變編碼蛋白質(zhì)性質(zhì)，此時Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果表現(xiàn)為利福平假陽性，表型培養(yǎng)藥敏敏感;這些Xpert MTB/RIF檢測假陽性患者給予一線抗結(jié)核藥物仍然有成功治愈的可能，臨床需謹慎甄別。
⑤異質(zhì)性耐藥。異質(zhì)性耐藥是指在臨床同一類患者體內(nèi)分離出結(jié)核分枝桿菌樣本中同時存在敏感和耐藥菌株，敏感和耐藥菌株共同感染或敏感株部分亞群發(fā)生耐藥突變所致。當存在異質(zhì)性耐藥的MTB中耐藥亞群比例高于分子檢測的敏感度時，臨床檢測出并判斷為耐藥;當耐藥亞群比例低于分子檢測敏感度時，就會判讀為敏感，導(dǎo)致部分MTB的分子檢測與表型耐藥檢測結(jié)果不一致。本研究結(jié)果顯示，有22例快速分子檢測利福平（RFP）敏感，表型藥敏檢測耐藥，分子檢測假敏感可能與異質(zhì)性耐藥有關(guān)。分子檢測需達到≥20%以上的耐藥亞群時才能檢測出，而表型藥敏可檢測出1%的耐藥菌株。異質(zhì)性耐藥反映了MTB群體從部分耐藥向全體耐藥轉(zhuǎn)變的中間過程。
⑥基因突變以外的其他耐藥機制引起的MTB耐藥。另外2例異煙肼（INH）、利福平（RFP）分子檢測敏感但表型藥敏耐藥不一致的原因不明，可能存在藥物外排泵、MTB細胞壁增厚難以穿透、抗結(jié)核藥物失活等由基因突變以外的其他耐藥機制所致。
綜上所述，分子DST檢測及表型DST藥敏診斷技術(shù)的應(yīng)用，給“終結(jié)結(jié)核病策略”提供了診斷工具，給臨床耐藥結(jié)核病的治療帶來了診斷“金標準”。建議在有條件的定點醫(yī)院結(jié)核病實驗室可使用兩種檢測方法平行檢測以提高精準度;當臨床檢測中發(fā)現(xiàn)初始分子檢測與表型藥敏結(jié)果不一致時，應(yīng)認真分析原因、及時調(diào)整治療方案、實施個體化精準診療策略，提高耐藥結(jié)核患者的治愈率。
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