顯微鏡直接計(jì)數(shù)法應(yīng)用于原料乳細(xì)菌總數(shù)計(jì)算
通過對原料乳細(xì)菌數(shù)量采用顯微鏡直接細(xì)菌計(jì)數(shù)方法和國標(biāo)GB478.2-2010菌落總數(shù)測定方法進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，確定了顯微鏡直接細(xì)菌計(jì)數(shù)方法和國標(biāo)GB478.2-2010方法間良好相關(guān)性。結(jié)果表明，顯微鏡直接計(jì)數(shù)方法檢測時(shí)間短，且檢測成本低廉，可以作為原料乳驗(yàn)收的輔助方法使用。
原料乳細(xì)菌總數(shù)是衡量生牛乳原料的重要指標(biāo)。然而鮮乳的菌落總數(shù)指標(biāo)按照GB478.2-2010方法進(jìn)行檢測需時(shí)48h，無法滿足原料乳快速驗(yàn)收的要求。如果細(xì)菌超標(biāo)的原料乳被用于加工生產(chǎn)，則為加工過程乃至終產(chǎn)品品質(zhì)帶來影響。
現(xiàn)今用于鮮乳快速計(jì)數(shù)的檢測方法有顯微鏡檢法、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法45、還原實(shí)驗(yàn)法光電法、電導(dǎo)分析法與阻抗分析法、ATP熒光計(jì)數(shù)法、PCR技術(shù)。各種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，有的方法快速但成本昂貴，有的方法操作繁瑣復(fù)雜。
顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是基于光學(xué)顯微鏡觀察方法，對視野中單個(gè)細(xì)菌、菌團(tuán)、酵母、霉菌等微生物的直接計(jì)數(shù)方法。本文摸索生乳細(xì)菌直接鏡檢計(jì)數(shù)方法并與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法進(jìn)行比對，現(xiàn)就該方法的具體情況做一闡述。
1實(shí)驗(yàn)
1.1材料與試劑
2016年5月和6月三次在娃哈哈公司奶源基地采集牛乳，每次采集牛乳10個(gè)左右，25室溫保存直至檢測，3次共計(jì)28個(gè)樣品；0.1%呂氏堿性美藍(lán)染色液；平板計(jì)數(shù)瓊脂。
1.2儀器與設(shè)備
超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，生化培養(yǎng)箱，漩渦震蕩儀，顯微鏡。
1.3方法
采用菌落總數(shù)計(jì)數(shù)和顯微鏡直接計(jì)數(shù)方法對同一樣品，同時(shí)進(jìn)行取樣的模式進(jìn)行檢測。
1.3.1菌落總數(shù)
參見GB4789.2-2010。
1.3.2顯微鏡直接計(jì)數(shù)方法
（1）涂片。在載玻片上用標(biāo)尺畫1 cm×1 cm方框，用微量移液器吸取10μL振蕩后的牛乳，滴加至方框中央，并用無菌接種環(huán)將奶液涂勻使其平鋪于方框內(nèi)。
（2）風(fēng)干。將涂布好的標(biāo)本置于通風(fēng)處吹干至完全干燥。
（3）固定。將玻璃染色支架放在沸水浴上，然后將干燥的涂片置于染色支架上。用蒸汽固定10 min以上。并風(fēng)干。
（4）染色。取0.1%呂氏堿性美藍(lán)染色液對標(biāo)本進(jìn)行浸染，染色時(shí)間為2 min。取出載玻片，用吸水紙吸取多余的染料，晾干。
（5）觀察。油鏡下觀察細(xì)菌數(shù)，共計(jì)數(shù)20個(gè)視野細(xì)菌數(shù)量，最終求細(xì)菌數(shù)量平均值。
2結(jié)果與分析
2.1顯微直接計(jì)數(shù)方法檢測原料乳細(xì)菌總數(shù)的重復(fù)性
用顯微直接計(jì)數(shù)方法計(jì)對細(xì)菌總數(shù)不同的28個(gè)奶樣同時(shí)用兩種方法進(jìn)行多次檢測，分析用顯微直接計(jì)數(shù)方法檢測原料乳細(xì)菌總數(shù)的可靠性，結(jié)果如表1所示。
表1顯微直接計(jì)數(shù)方法檢測原料乳細(xì)菌總數(shù)的重復(fù)性
通過對細(xì)菌總數(shù)不同的奶樣進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)檢測結(jié)果（表1）可知，所有數(shù)據(jù)變異系數(shù)都小于2%，說明使用顯微計(jì)數(shù)方法重復(fù)性良好，計(jì)數(shù)平均值具有好的代表性。
2.2兩種方法檢測牛乳細(xì)菌總數(shù)的比較
同時(shí)用顯微直接計(jì)數(shù)方法與GB4789.2-2010對鮮乳菌落總數(shù)計(jì)數(shù)兩種方法對細(xì)菌含量不同的28個(gè)鮮乳樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖1）表明，顯微直接計(jì)數(shù)方法與GB4789.2-2010對鮮乳菌落總數(shù)兩種方法間存在良好的線性關(guān)系，y=5625.2x+921.31，R2=0.9224。
2.3顯微直接計(jì)數(shù)方法結(jié)果
以美蘭為染色劑的顯微直接計(jì)數(shù)方法所觀察到的樣品呈現(xiàn)藍(lán)色背景，其中脂肪球在顯微鏡下形成明亮的小滴，有強(qiáng)烈的折射光，由于光學(xué)現(xiàn)象所致，每個(gè)脂肪球表面如有層膜包覆。所有微生物包括細(xì)菌和酵母等形態(tài)微生物被染上較深的藍(lán)色，其在視野中以較清晰的形態(tài)存在，如圖2所示。
圖1兩種檢測方法的線性關(guān)系
圖2顯微直接計(jì)數(shù)方法圖片
3結(jié)論
本研究所采用直接計(jì)數(shù)方法是以顯微鏡觀察為基礎(chǔ)，通過制片、染色和觀察等幾個(gè)簡單的步驟直接對樣品中細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)方法：
（1）從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，運(yùn)用顯微鏡直接計(jì)數(shù)方法檢測原料乳細(xì)菌總數(shù)與國標(biāo)方法具有良好的線性（R2=0.9224）。（2）顯微計(jì)數(shù)時(shí)視野的選擇需要選擇微生物分布均勻的視野，需要一個(gè)個(gè)計(jì)數(shù)，不管兩個(gè)相連或成堆成鏈，均需一個(gè)個(gè)計(jì)數(shù)，菌團(tuán)按一個(gè)計(jì)數(shù)；并在本研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)視野內(nèi)細(xì)菌數(shù)量過多時(shí)，計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性明顯降低。（3）該方法的優(yōu)點(diǎn)為能夠在20 min內(nèi)完成原料乳中的細(xì)菌總數(shù)的檢測，與GB4789.2-2010方法相比，可以改善由于傳統(tǒng)國標(biāo)方法培養(yǎng)48h出結(jié)果所造成的細(xì)菌總數(shù)過多而已經(jīng)投入使用的狀況。（4）與FOSS等細(xì)胞計(jì)數(shù)儀相比，該方法驗(yàn)收且成本低廉，是一種值得推廣的新型技術(shù)。
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方案對A1B3C2與A1B3C3進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)，A1B3C2得最終平均離心率為0.487%，A1B3C3得最終平均離心率為0.484%，兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常接近，且觀察21 d后，兩組產(chǎn)品沉淀非常少，析水約0.3 cm，從經(jīng)濟(jì)效益的角度考慮，選擇A1B3C2較為適宜。
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