枯草芽孢桿菌計數(shù)方法、稀釋培養(yǎng)步驟與注意事項
在固體培養(yǎng)基上，枯草芽孢桿菌通常形成不規(guī)則的邊緣波浪狀或皺褶狀菌落。菌落顏色通常為乳白色至淡黃色，菌落表面較為干燥，質(zhì)地粗糙。
枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性桿菌，呈短桿狀或鏈狀排列，在營養(yǎng)不足或其他壓力條件下，枯草芽孢桿菌會形成芽孢。芽孢一般呈橢圓形，位于細(xì)胞的一端或中央，具有較高的抗逆性。
培養(yǎng)基的配置
具體步驟
①根據(jù)上表比例配置400mL的LB培養(yǎng)基，將封口膜封緊后放入高壓滅菌鍋中，121℃滅菌30min。②將培養(yǎng)基取出，放涼至50℃左右（用手摸錐形瓶不燙手）。③在超凈工作臺將放涼的培養(yǎng)基倒入平皿。④將平皿吹干，防止冷凝水聚集在平皿蓋上。
注意事項：①無菌操作至關(guān)重要，超凈工作臺要提前紫外燈光滅菌，進(jìn)入超凈工作臺的物與手都需要酒精消毒處理，同時，倒平板時需要在火焰旁進(jìn)行。②平板倒置存放，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的冷凝水落入培養(yǎng)基，造成污染。③滅菌前應(yīng)先檢查培養(yǎng)基的pH值是否在適宜范圍內(nèi)，pH的適宜范圍在：7.0~7.2。
檢樣制備與接種
初始懸液與十倍稀釋
以無菌操作稱取試樣1g，加入9mL 0.85%滅菌生理鹽水，均質(zhì)1min~2min，制成1:10的初始懸浮液。吸取1:10的初始懸浮液1mL，加入9mL 0.85%滅菌生理鹽水，經(jīng)充分混勻后制成1:100的稀釋液。據(jù)此方法進(jìn)一步進(jìn)行十倍系列遞增稀釋。
接種和培養(yǎng)
選擇3個適宜的稀釋度，用無菌移液管分別吸取0.1mL，接種到三個LB平板上。使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面。涂布好的平皿蓋好，室溫中放置15min，使接種物完全被瓊脂吸收。翻轉(zhuǎn)平皿在37℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
3注意事項①注意全程必須無菌操作。
②涂布棒在涂布前應(yīng)經(jīng)火焰灼燒，并且冷卻后才可涂布。一個平皿用一支無菌涂布棒涂布。
③倒置培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
菌落計數(shù)計算方式
選取某一稀釋度的枯草芽孢桿菌菌數(shù)介于30~300的平板，通過下式計算，即為1mL或1g樣品中的枯草芽孢桿菌數(shù)：N=ΣA/(V*n*d)式中：N——每克或每毫升樣品中枯草芽孢桿菌菌數(shù)，單位為CFU/g（mL）。ΣA——該稀疏度的所有平板枯草芽孢桿菌菌數(shù)總和；V——平板的接種體積，單位為毫升（mL）;n——該稀釋度的平板數(shù)；d——該稀疏度的稀釋因子。
檢測結(jié)果
通過計數(shù)，在10-8的稀釋梯度下，三個重復(fù)實驗的平板上菌落數(shù)分別是131、102、120。故：每克樣品中枯草芽孢桿菌菌數(shù)N=（131+102+120）/（0.1*3*10-8)=1.1*1011 CFU/g。
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