結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗：細(xì)菌計數(shù)儀VS磨菌瓶，哪個更好用
目的：評估細(xì)菌超聲分散計數(shù)儀（簡稱“細(xì)菌計數(shù)儀”）在結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗（簡稱“藥敏試驗”）中的生物安全優(yōu)勢。方法：使用細(xì)菌計數(shù)儀和磨菌瓶兩種方法對結(jié)核分枝桿菌做藥敏試驗，操作過程中在安全柜內(nèi)用FA-2型撞擊式空氣微生物采樣器采集空氣，接種中性羅氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察菌落生長情況。
結(jié)果：細(xì)菌計數(shù)儀操作過程中，空氣采樣培養(yǎng)后無菌落生長，磨菌瓶操作過程中，空氣采樣培養(yǎng)后有少量菌落生長。結(jié)論：在分枝桿菌藥敏試驗的菌懸液制備過程中，對比傳統(tǒng)磨菌瓶處理方法，細(xì)菌計數(shù)儀處理能更快、操作時間短，使用菌量更少，靜置同樣時間開蓋后產(chǎn)生氣溶膠含菌量低。大大降低了結(jié)核藥敏試驗這種大量活菌操作試驗給操作者和環(huán)境帶來的生物安全隱患，同時不影響菌株的活性和藥敏試驗結(jié)果。
結(jié)核分枝桿菌（MTB）的藥物敏感性試驗（簡稱“藥敏試驗”）是耐藥結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。目前在我國各級結(jié)核病診斷實驗室中，最常用的耐藥檢測方法仍然是基于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的比例法和MGIT 960的液體比例法，而菌懸液標(biāo)本的制備是其關(guān)鍵步驟。常用的方法是磨菌瓶法：通過振蕩瓶中的玻璃珠與菌落，從而使菌落分散，然后加入含0.5%Tween-80的生理鹽水進(jìn)行稀釋，與麥?zhǔn)?號標(biāo)準(zhǔn)比濁管或比濁儀比濁并稀釋至1個麥?zhǔn)蠞岫龋∕CF），經(jīng)稀釋后接種到含藥羅氏管進(jìn)行耐藥性檢測。上述方法雖然能使菌落分散成菌體，成功完成藥敏檢測，但存在操作繁鎖、耗時長、比濁粗糙，用菌量大，以及生物安全風(fēng)險等問題。而細(xì)菌超聲分散計數(shù)儀采用超聲分散的原理使菌落分散，同時自動檢測濁度，最后經(jīng)人工接種到含藥培養(yǎng)管培養(yǎng)進(jìn)行耐藥性檢測，具有操作簡單、減少開蓋次數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化，耗時短，用菌量少，減少生物安全風(fēng)險等優(yōu)勢。
本研究分別采用細(xì)菌超聲分散計數(shù)儀（簡稱“細(xì)菌計數(shù)儀”）和傳統(tǒng)的研磨瓶法制備臨床MTB菌株的菌懸液樣本，制作過程中采集空氣樣本培養(yǎng)，以評估細(xì)菌計數(shù)儀在MTB藥敏試驗中的生物安全優(yōu)勢。
1.材料與方法
1.1一般材料
菌株來源：實驗中所用的菌株為本實驗室耐多藥可疑者篩查項目菌株，傳代后5周。狀態(tài)最好時期。
儀器與試劑：①儀器：細(xì)菌超聲分散計數(shù)儀（超聲功率為19W；廣東體必康生物科技有限公司生產(chǎn)）、37°C恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜、FA-2型撞擊式空氣微生物采樣器，微量震蕩器。②試劑耗材：磨菌瓶、羅氏中性培養(yǎng)基、接種環(huán)、生理鹽水、0.5%Tween-80生理鹽水、超聲分散專用試管。
1.2方法
磨菌瓶法菌懸液制備：用一次性10μL接種環(huán)挑取羅氏培養(yǎng)基內(nèi)菌落約一環(huán)，放入磨菌瓶中，擰緊瓶蓋，在震蕩器上震蕩30s，震蕩過程中調(diào)整磨菌瓶角度，使玻璃珠在磨菌瓶內(nèi)轉(zhuǎn)動。震蕩后靜置15min，靜置后開蓋加入適量生理鹽水（此步驟開始使用FA-2型撞擊式空氣微生物采樣器采集生物安全柜內(nèi)空氣樣品），比濁儀比濁，按照比濁儀提示稀釋至1MCF（1mg/mL）。結(jié)束空氣采樣，將采樣膜處理后，用無菌尼龍拭子涂抹于中性羅氏培養(yǎng)基表面，放入37°C溫箱培養(yǎng)。
細(xì)菌計數(shù)儀法菌懸液制備：用一次性10μL接種環(huán)挑取羅氏培養(yǎng)基內(nèi)菌落約四分之一環(huán)，放入預(yù)先加有2mL生理鹽水的超聲分散專用試管中，然后將該試管放入細(xì)菌計數(shù)儀中進(jìn)行超聲分散：超聲5s，間隔5s，持續(xù)1min。取出后靜置15min，根據(jù)儀器提示加入相應(yīng)體積稀釋液（此步驟開始使用FA-2型撞擊式空氣微生物采樣器采集生物安全柜內(nèi)空氣樣品），將菌懸液稀釋至1MCF（1mg/mL）。結(jié)束空氣采樣，將采樣膜處理后，用無菌尼龍拭子涂抹于中性羅氏培養(yǎng)基表面，放入37°C溫箱培養(yǎng)。
2.結(jié)果
使用磨菌瓶法制備7份菌懸液，用時1h，采樣時間20min，接種10支羅氏中性培養(yǎng)基，使用細(xì)菌計數(shù)儀法制備制備7份菌懸液，用時30min，采樣時間20min，接種10支羅氏中性培養(yǎng)基。經(jīng)過37°C培養(yǎng)8周，結(jié)果見表1。
表1.兩種方法制備菌懸液培養(yǎng)基陽性及菌落數(shù)比較(n)
3.討論
人及動物結(jié)核病的病原菌是結(jié)核分枝桿菌（TB），發(fā)病率最高的是以人型結(jié)核分枝桿菌，約占百分之九十，接下來接是牛型，其他分枝桿菌所致感染非常少見。近年來國內(nèi)有不少有關(guān)生物安全防護(hù)、生物安全管理、防護(hù)設(shè)備調(diào)查的實驗室生物安全問題發(fā)生，越來越引起人們的重視。一般涉及MTB生物安全的文獻(xiàn)較少，缺乏相應(yīng)的實驗數(shù)據(jù)支持，主要為說明操作規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。難以避免產(chǎn)生氣溶膠在日常檢測MTB的實驗活動中，如痰樣本混勻、離心、開啟培養(yǎng)皿和安瓿，樣本涂片、意外事件如培養(yǎng)物的濺出和潑灑、培養(yǎng)液的傾倒和轉(zhuǎn)移、離心管破碎等都可造成嚴(yán)重污染。主要原因是因為大部分實驗室感染人員在處理臨床樣本和培養(yǎng)物過程中吸入產(chǎn)生的含病原體的氣溶膠所致。醫(yī)務(wù)人員存在較高的感染風(fēng)險，在結(jié)核病患者較多活動的醫(yī)療衛(wèi)生單位。結(jié)核防治工作人員結(jié)核病發(fā)病水平顯著高于一般人群。長期以來，我國各級實驗室通常采用手工磨菌、人工比濁的方法對MTB進(jìn)行研磨分散與比濁稀釋后進(jìn)行比例法或絕對濃度法的藥敏試驗。手工磨菌過程容易產(chǎn)生可開放擴(kuò)散的氣溶膠，且研磨過程中存在液體迸濺的風(fēng)險，即使在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行磨菌操作，手工磨菌的過程仍然存在較大的生物安全隱患。因此，在傳統(tǒng)藥敏試驗的前期菌懸液制備階段，通過細(xì)菌計數(shù)儀來代替?zhèn)鹘y(tǒng)磨菌瓶研磨處理，處理能力更快、操作時間短，使用菌量更少，靜置同樣時間開蓋后產(chǎn)生氣溶膠含菌量低。大大降低了結(jié)核藥敏試驗這種大量活菌操作試驗，給操作者和環(huán)境帶來的生物安全隱患。同時不影響菌株的活性和藥敏試驗結(jié)果。
細(xì)菌超聲分散計數(shù)儀可以用于結(jié)核分枝桿菌等微生物藥敏試驗的菌懸液制備、細(xì)菌分離培養(yǎng)的菌落分散及濁度評測、以及菌種鑒定、菌種保藏的樣品前處理等。在超聲波的作用下，超聲分散專用試管中的微小氣泡核會產(chǎn)生振動，當(dāng)聲壓達(dá)到一定值時，氣泡將迅速膨脹，然后突然閉合，在氣泡閉合時產(chǎn)生沖擊波。細(xì)菌超聲分散計數(shù)儀的分散功能就是利用這種超聲空化作用，完成對結(jié)團(tuán)性細(xì)菌的分散。細(xì)菌超聲儀利用90°散射光特性，即不論光源波長和待檢測細(xì)菌直徑大小關(guān)系如何，在菌液濃度一定時，90°方向上散射光強(qiáng)度保持恒定。再利用光傳感器把光信號轉(zhuǎn)化為電信號，最終使菌液濃度以麥?zhǔn)蠞岫鹊姆绞匠尸F(xiàn)在系統(tǒng)里。在結(jié)核菌的藥敏試驗中，常規(guī)方法受到結(jié)核菌成團(tuán)性以及氣溶膠生物安全隱患的影響，在試劑操作中存在著極大的不便，而細(xì)菌超聲細(xì)菌計數(shù)儀不僅可以完成菌團(tuán)的分散，而且對菌液的濃度進(jìn)行了檢測，為實驗人員提供了安全、高效和標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)核菌操作方案。
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