利用CIRBP作為胰腺癌診斷及治療分子標(biāo)記物（細(xì)胞增殖生長曲線檢測步驟）
RIP技術(shù)(RNABindingProteinImmunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀)，是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。運(yùn)用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析；即用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白，防止非特異性的RNA的結(jié)合，免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來，結(jié)合的RNA序列通過microarray(RIP-Chip)，定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定；目標(biāo)蛋白是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，在應(yīng)激反應(yīng)過程中，可以從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)，此外，目標(biāo)蛋白還可以從細(xì)胞中分泌出來，在細(xì)胞外作為損傷相關(guān)分子模式發(fā)揮功能，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，并在急性和慢性炎癥中發(fā)揮重要作用。
一種利用CIRBP作為胰腺癌診斷及治療分子標(biāo)記物的方法，所述方法步驟包括如下：
步驟1：材料準(zhǔn)備，準(zhǔn)備試劑細(xì)胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清，DMEM-高糖培養(yǎng)基，RPMI-1640培養(yǎng)基，青鏈霉素，PBS磷酸鉀緩沖液，Trypsin-EDTA(0.25％)phenol red以及實(shí)驗(yàn)耗材6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，12孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，24孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，48孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，巴氏吸管；
步驟2：細(xì)胞復(fù)蘇，將水浴鍋預(yù)熱至37℃，用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面，在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等，取出凍存管，迅速解凍，迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化，在凍存管內(nèi)還存在一點(diǎn)點(diǎn)沒融化的時(shí)候，取出，用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)，制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一個(gè)15ml離心管內(nèi)，一滴一滴地加入預(yù)熱好的培養(yǎng)基，同時(shí)一邊晃動離心管；加入培養(yǎng)基的量要達(dá)到10ml以上，離心，在低速離心機(jī)上，以800rpm離心5分鐘；吸去上清，然后用1ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿放入37℃含CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞沉降速度情況而定；
步驟3：細(xì)胞培養(yǎng)，將水浴鍋預(yù)熱至37℃，用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面，在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，無菌操作，打開瓶蓋，吸掉舊培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞一至二次，加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，輕洗細(xì)胞皿底部，吸掉trypsin-EDTA溶液，放入37℃培養(yǎng)箱2-3分鐘，輕拍培養(yǎng)瓶壁使大部分細(xì)胞脫落，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用；
步驟4：實(shí)驗(yàn)分組，檢測項(xiàng)目為RIP檢測CIRBP調(diào)控TP53、、PCR檢測CIRBP、TP53、wb、CIRBP、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4、FTH1、普魯士藍(lán)染色、激光共聚焦檢測線粒體活性氧ROS、谷胱甘肽GSH檢測、流式凋亡檢測、細(xì)胞增殖生長曲線檢測；
步驟4中細(xì)胞增殖生長曲線檢測步驟為a：取各處理組細(xì)胞進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)；b：消化細(xì)胞后吹打散細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔細(xì)胞為1×104個(gè)；c：貼壁細(xì)胞需待細(xì)胞貼壁后，再收集各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞進(jìn)行檢測；d：收集各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞(0h，24h，48h，72h)加入CCK-8溶液(碧云天，Cat.No.C0037)，比例為1/10。即100ul培養(yǎng)液加入10ul檢測液；e：在孵育4小時(shí)后，酶標(biāo)儀讀板，CCK-8檢測讀取OD450數(shù)據(jù)。
步驟5：RIP檢測P CIRBP調(diào)控TP53。
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