一文了解細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的定義、階段、影響因素以及應(yīng)用
細(xì)菌作為生命體的一種，其生長(zhǎng)過程并非一成不變，而是遵循著一定的生長(zhǎng)曲線。這一曲線不僅是生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，同時(shí)也對(duì)于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域具有深遠(yuǎn)影響。本文將從細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的定義、階段、影響因素以及應(yīng)用等方面進(jìn)行詳細(xì)闡述。
一、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的定義
細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，是指細(xì)菌在特定環(huán)境下，隨時(shí)間的推移，其數(shù)量增長(zhǎng)所呈現(xiàn)出的變化趨勢(shì)。這一曲線通常通過實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)過程的連續(xù)觀察和測(cè)量得到，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)菌數(shù)量為縱坐標(biāo)繪制而成。細(xì)菌生長(zhǎng)曲線反映了細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中的動(dòng)態(tài)變化，是研究細(xì)菌生長(zhǎng)規(guī)律的重要工具。
二、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的階段
細(xì)菌生長(zhǎng)曲線通常可分為四個(gè)階段：遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期。
1.遲緩期：細(xì)菌接種至新鮮培養(yǎng)基后，并不立即開始生長(zhǎng)和繁殖，而是有一個(gè)短暫的適應(yīng)期。在這一階段，細(xì)菌主要進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)代謝的調(diào)整和準(zhǔn)備，為接下來的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期做準(zhǔn)備。遲緩期的長(zhǎng)短取決于細(xì)菌的種類、接種量、培養(yǎng)基的種類和條件等因素。
2.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：遲緩期過后，細(xì)菌開始迅速生長(zhǎng)和繁殖，數(shù)量呈幾何級(jí)數(shù)增加。在這一階段，細(xì)菌的生長(zhǎng)速度最快，代謝最為旺盛。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是細(xì)菌生長(zhǎng)的主要階段，也是實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)生產(chǎn)中最為關(guān)注的時(shí)期。
3.穩(wěn)定期：隨著細(xì)菌數(shù)量的不斷增加，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗殆盡，同時(shí)代謝產(chǎn)物積累，細(xì)菌生長(zhǎng)速度逐漸下降，進(jìn)入穩(wěn)定期。在穩(wěn)定期，細(xì)菌數(shù)量基本保持穩(wěn)定，不再有明顯的增加。
4.衰亡期：當(dāng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被完全消耗，且代謝產(chǎn)物的積累達(dá)到一定程度時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)環(huán)境變得惡劣，細(xì)菌開始大量死亡，數(shù)量迅速下降，進(jìn)入衰亡期。
三、影響細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的因素
細(xì)菌生長(zhǎng)曲線受到多種因素的影響，主要包括以下幾個(gè)方面：
1.細(xì)菌的種類和特性：不同種類的細(xì)菌具有不同的生長(zhǎng)特性和需求，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性也不同，因此其生長(zhǎng)曲線也會(huì)有所差異。
2.培養(yǎng)基的成分和條件：培養(yǎng)基是細(xì)菌生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，其成分和條件對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)速度和數(shù)量有著重要影響。例如，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的種類、濃度、pH值、溫度、氧氣濃度等因素都會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。
3.接種量和接種時(shí)間：接種量和接種時(shí)間對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線也有一定影響。接種量過大或過小，接種時(shí)間過早或過晚，都可能影響細(xì)菌的生長(zhǎng)速度和數(shù)量。
4.環(huán)境因素：環(huán)境因素如溫度、濕度、光照、氣壓等也會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線產(chǎn)生影響。適宜的環(huán)境條件可以促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，而不利的環(huán)境條件則會(huì)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。
四、細(xì)胞培養(yǎng)期生長(zhǎng)的影響因素
溫度
一般哺乳類及禽類細(xì)胞體外培養(yǎng)的適宜溫度是37~38℃。溫度過高或過低都會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞耐受低溫的能力比抗熱的能力強(qiáng)，在低溫下，細(xì)胞的代謝活力及核分裂降低。
溫度不低于0℃時(shí)，雖影響細(xì)胞代謝，但并無傷害作用；
把細(xì)胞置于25～35℃時(shí)，細(xì)胞仍能生存和生長(zhǎng)，但速度減緩；
放在40℃數(shù)小時(shí)后，再置回37℃培養(yǎng)細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)；
如果在40℃下暴露時(shí)間太長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利，甚至變圓脫落于瓶壁；
若溫度過低，在降到冰點(diǎn)以下時(shí)，細(xì)胞因胞外水和胞質(zhì)結(jié)冰而受損死亡；
但若向培養(yǎng)液中加入甘油或二甲亞砜等保護(hù)劑，封入安瓿中后，置于液氮中，可起保護(hù)作用，此時(shí)細(xì)胞可耐受-70℃以下溫度，能長(zhǎng)期儲(chǔ)存，解凍后細(xì)胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)生長(zhǎng)增殖，細(xì)胞生物性狀不受任何影響。此為保存細(xì)胞的主要手段。
細(xì)胞在39～40℃培養(yǎng)1小時(shí)，能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)，但不能忍受溫度再升高2℃，持續(xù)數(shù)小時(shí)，即在41～42℃中培養(yǎng)1小時(shí)，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，溫度至43℃以上時(shí)細(xì)胞多數(shù)被殺死。高溫主要引起酶的滅活、類脂質(zhì)破壞，核分裂的破壞，產(chǎn)生凝固酶使細(xì)胞發(fā)生凝固，另外使蛋白質(zhì)變性。因此，體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)一定要避免高溫。
滲透壓
細(xì)胞在高滲溶液或低滲溶液中，可以立即發(fā)生皺縮或腫脹、破裂。所以，滲透壓是體外培養(yǎng)細(xì)胞的重要條件之一。哺乳動(dòng)物和其他動(dòng)物組織細(xì)胞體外培養(yǎng)的滲透壓的維持主要與NaCl有關(guān)，但不能忽視其他電介質(zhì)滲透壓的關(guān)系。滲透壓與單位體積溶媒內(nèi)溶質(zhì)的分子數(shù)和離子數(shù)成正比。為此，按一定比例控制培養(yǎng)液中離子平衡，維持正常滲透壓是很重要的。這不僅是為了維持細(xì)胞張力，而且是為了調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝。因?yàn)榧?xì)胞外離子輸送和離子濃度改變著其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送(如氨基酸、蔗糖等)，直接影響細(xì)胞基本合成系統(tǒng)。
理想的滲透壓因細(xì)胞的類型及種族而異，人血漿滲透壓為290mmol/L，被視為是體外培養(yǎng)人類細(xì)胞的理想滲透壓。哺乳類動(dòng)物細(xì)胞的滲透壓一般為290～300mmol/L。人胚肺成纖維細(xì)胞為250～325mmol/L，鼠則為310mmol/L左右。在實(shí)際應(yīng)用中，260～320mmol/L的滲透壓可適于大多數(shù)細(xì)胞。體外培養(yǎng)細(xì)胞需要理想的氣體環(huán)境，
氧和二氧化碳
氧和二氧化碳是細(xì)胞生存必須的條件之一。氧參加細(xì)胞的三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量以供給細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和合成各種所需成分。有些細(xì)胞在低氧條件下，可借糖酵解取得能量，但多數(shù)細(xì)胞低氧時(shí)不能生存。氧張力通常維持在略低于大氣狀態(tài)，若氧分壓超過大氣中氧的含量可能對(duì)有些細(xì)胞有害。采用開放式培養(yǎng)時(shí)(碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng))，一般要把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳的混合氣體環(huán)境中。
CO2既是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，又是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的成分，并與維持培養(yǎng)液的pH有關(guān)。在密閉瓶中CO2濃度偏低的情況下，細(xì)胞容易生長(zhǎng)；一般不能低于1%，否則有損細(xì)胞。CO2增加將使pH下降。大多數(shù)細(xì)胞適于在pH6.8~pH7.4條件下生長(zhǎng)，低于pH6.8或高于pH7.6對(duì)細(xì)胞有害，甚至退變或死亡。
各種細(xì)胞對(duì)pH的要求不盡相同。一般原代培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)pH的變動(dòng)耐受性差，永生性細(xì)胞系和惡性細(xì)胞對(duì)pH的變動(dòng)耐力強(qiáng)。但總的來說，細(xì)胞對(duì)堿性不如對(duì)酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利。細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動(dòng)的加強(qiáng)，不斷釋放CO2，使培養(yǎng)基變酸，pH發(fā)生變化。所以，為了維持培養(yǎng)環(huán)境恒定的pH，多采用在培養(yǎng)液中加入磷酸鹽等緩沖劑的方法。磷酸緩沖劑中的NaHCO3可供給CO2，但CO2易于逸出，故只適用于封閉式培養(yǎng)。若開放式培養(yǎng)還是置于含有5%CO2的氣體環(huán)境中為宜。
可見光
可見光的波長(zhǎng)是3900~7800?。可見光的各種有色光能引起細(xì)胞退變，延長(zhǎng)核分裂的間期，還可顯著降低貼壁細(xì)胞的附壁能力。因此，體外培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)避免日光直接照射，最好在黑暗中進(jìn)行培養(yǎng)或短期存放。
紫外線
弱紫外線下耐受能力強(qiáng)的細(xì)胞變化不大，但對(duì)敏感的細(xì)胞有損害。紫外線強(qiáng)時(shí)，新分離的細(xì)胞顯示：
不能進(jìn)行完全的有絲分裂；
在有絲分裂時(shí)增加了脫水收縮；
在有絲分裂時(shí)細(xì)胞質(zhì)的起泡減少。
研究發(fā)現(xiàn)，腹水癌細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后，用飛點(diǎn)紫外線顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)被照射表面形成水泡，隨后細(xì)胞膨脹，損害也漸變嚴(yán)重。
放射線
X射線對(duì)細(xì)胞有明顯損傷；
β射線可影響細(xì)胞核的分裂；
γ射線使核分裂數(shù)減少并出現(xiàn)不正常的核分裂，可使細(xì)胞死亡；
超聲波和振動(dòng)
在超聲波振動(dòng)下，細(xì)胞很快會(huì)破裂，開始是胞質(zhì)發(fā)生紊亂的流動(dòng)，原生質(zhì)膠體結(jié)核也有明顯變化，若停止超聲波振動(dòng)可回復(fù)。細(xì)胞致死的原因是由于產(chǎn)生空化作用所致。
當(dāng)超聲波在2.5W/cm2時(shí)，細(xì)胞受損，染色體發(fā)生畸變，首先發(fā)生畸變的是核染色體。在體外培養(yǎng)細(xì)胞中，細(xì)胞接種數(shù)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有影響，適宜的接種密度，可以促使細(xì)胞增殖，接種密度太低或太高都不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。
攪拌轉(zhuǎn)速
當(dāng)懸浮攪拌培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，攪拌速度既不能太快，也不能太慢。
如太慢，細(xì)胞易結(jié)團(tuán)、下沉和貼壁，氧氣混合效果差，不利于細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下增殖；
如果太快，容易起泡沫，細(xì)胞易窒息致死，同時(shí)，強(qiáng)烈地?cái)噭?dòng)易使細(xì)胞因機(jī)械損傷而破裂。所以選擇適宜的攪拌速度很重要，一般不同規(guī)模的反應(yīng)器會(huì)有不同的反應(yīng)器的攪拌轉(zhuǎn)速，根據(jù)PV相等原則規(guī)模放大，綜合考慮定不同的轉(zhuǎn)速。
五、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的應(yīng)用
細(xì)菌生長(zhǎng)曲線在多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。在醫(yī)藥領(lǐng)域，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的研究有助于了解細(xì)菌的生長(zhǎng)規(guī)律和耐藥機(jī)制，為抗生素的研發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的研究有助于了解作物病原菌的生長(zhǎng)特性，為病害防治提供有效手段。在食品工業(yè)領(lǐng)域，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的研究有助于了解食品中微生物的生長(zhǎng)規(guī)律和安全性評(píng)估，為食品安全控制提供重要參考。此外，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線還在環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物工程等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。
六、實(shí)例
牛奶中細(xì)菌的生長(zhǎng)情況
從健康乳牛剛擠出的牛乳，溫度一般為37℃，從理論上講細(xì)菌含量并不高，但在一般奶牛場(chǎng)的環(huán)境條件下，能夠使牛乳腐敗的細(xì)菌到處皆有，污染的機(jī)會(huì)及途徑很多，如擠奶過程中不講究衛(wèi)生，沒有做好必要的清潔衛(wèi)生工作，其每毫升乳中的細(xì)菌數(shù)可達(dá)100萬以上，甚至出現(xiàn)無法計(jì)數(shù)。
細(xì)菌的繁殖細(xì)菌一般通過裂殖進(jìn)行無性繁殖
1.繁殖的速度。在正常情況下，細(xì)菌的裂殖周期為20-30分鐘，因此，從理論上講，繁殖的模型如下：
在0.5小時(shí)2個(gè)細(xì)菌在1小時(shí)后4個(gè)
在1.5小時(shí)以后8個(gè)
在2小時(shí)以后16個(gè)
在11小時(shí)以后1000萬個(gè)
但是，在實(shí)際上，細(xì)菌的生長(zhǎng)速度很快地被營(yíng)養(yǎng)的缺乏、代謝毒物的積聚、不適宜的溫度條件等所抑制，最后繁殖停止，細(xì)菌大量死亡。
2.細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線在細(xì)菌開始繁殖的時(shí)候通常是較緩慢，因?yàn)樗齻儽仨毷紫冗m應(yīng)新環(huán)境，以后細(xì)菌開始迅速繁殖，此時(shí)繁殖以對(duì)數(shù)速度進(jìn)行，隨之細(xì)菌的繁殖速度又減慢，此時(shí)同時(shí)細(xì)菌不斷死亡，處于平衡狀態(tài)，最后，細(xì)菌的繁殖完全停止，老的細(xì)菌相繼死亡。該曲線的形狀，即各個(gè)階段的長(zhǎng)度和梯度變化因溫度、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和其他生長(zhǎng)參數(shù)的不同而變化。
牛乳中細(xì)菌的變化
1.鮮乳中細(xì)菌數(shù)的減少：擠出后的牛奶，在一定時(shí)間內(nèi)細(xì)菌數(shù)反而減少，這是因?yàn)樾迈r牛乳中存在著細(xì)菌抑制物質(zhì)，但這種細(xì)菌抑制物質(zhì)經(jīng)70℃20分鐘加熱后即被破壞。
2.鮮牛乳保存期間細(xì)菌的繁殖及其變化：鮮乳繼自體抑菌階段后，接著，乳中的乳酸菌、蛋白分解菌或大腸菌開始繁殖，以致產(chǎn)生酸敗、堿化、胨化以及產(chǎn)氣等現(xiàn)象。首先是乳酸菌繁殖最旺盛，產(chǎn)生酸凝固，接著乳酸菌受所產(chǎn)酸的抑制，因此耐酸的丙酸菌、孢子形成菌、酵母菌、霉菌等變成優(yōu)勢(shì)，最后由于孢子形成菌和腐敗菌的作用，牛乳出現(xiàn)敗壞現(xiàn)象。
牛乳中細(xì)菌生長(zhǎng)與溫度的關(guān)系
1.牛乳溫度在35-60℃時(shí)，嗜熱性細(xì)菌最易生長(zhǎng)，如嗜熱性的乳酸鏈球菌、酸性乳酸桿菌等。當(dāng)牛乳在20℃左右時(shí)，乳中所有細(xì)菌都能生長(zhǎng)，此時(shí)，牛乳中的細(xì)菌一般在20分鐘左右繁殖一代，經(jīng)12-24小時(shí)后，乳中的細(xì)菌可增殖約600倍。當(dāng)牛乳在4-10℃條件下，則嗜冷菌細(xì)菌適宜生長(zhǎng)，如芽孢桿菌熒光細(xì)菌等，經(jīng)12-24小時(shí)，乳中的細(xì)菌可增殖約5-15倍，當(dāng)牛乳在1-6℃條件下，乳中大部分細(xì)菌都被抑制生長(zhǎng)。
溫度的作用可由下列說明：
擠奶后立即取樣，40000個(gè)細(xì)菌/毫升；
在5℃下貯存24小時(shí)后，90000個(gè)細(xì)菌/毫升；
在10℃下貯存24小時(shí)后180000個(gè)細(xì)菌/毫升；
在15℃下貯存24小時(shí)后4500000個(gè)細(xì)菌/毫升。
2.冷卻溫度與牛乳保存時(shí)間的關(guān)系，見下表
為了抑制細(xì)菌繁殖，必須盡快將牛乳冷卻，隨著溫度的下降，細(xì)菌繁殖速度也將逐漸下降。
綜上所述，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線是研究細(xì)菌生長(zhǎng)規(guī)律的重要工具，對(duì)于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域具有深遠(yuǎn)影響。
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