微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)：12種LAB發(fā)酵物對(duì)霉菌生長(zhǎng)的抑制作用
霉菌腐敗是乳制品行業(yè)的一個(gè)主要問(wèn)題，導(dǎo)致大量食物浪費(fèi)和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。乳制品為霉菌生長(zhǎng)提供了有利的環(huán)境，由于產(chǎn)品表面的生長(zhǎng)，可以發(fā)現(xiàn)明顯的變化。一些最常見(jiàn)的霉菌，例如青霉屬和毛霉屬，與乳制品腐敗有關(guān)。為了避免食品工業(yè)中的真菌腐敗，在產(chǎn)品制造過(guò)程中采取了很多措施來(lái)防止污染并抑制真菌生長(zhǎng)。化學(xué)防腐劑已在食品工業(yè)中使用，以保護(hù)食品免受不良生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期，但公眾對(duì)化學(xué)防腐劑的廣泛使用越來(lái)越關(guān)注。此外，越來(lái)越多的霉菌不僅對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性，而且對(duì)山梨酸和苯甲酸等食品防腐劑產(chǎn)生抗藥性。近年來(lái)，消費(fèi)者對(duì)最低限度加工或不含防腐劑的食品的需求不斷增加，這導(dǎo)致人們對(duì)天然真菌控制替代品（例如抗真菌生物保護(hù)培養(yǎng)物）越來(lái)越感興趣。選定的乳酸菌（LAB）通常被報(bào)道為潛在的生物保存工具，可以抑制不同食品中的真菌生長(zhǎng)，延長(zhǎng)保質(zhì)期，有時(shí)甚至改善營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官特性。LAB菌株對(duì)抗腐敗霉菌的活性機(jī)制被認(rèn)為是多因素的，包括產(chǎn)生各種代謝物，包括揮發(fā)性化合物和非揮發(fā)性化合物。
本研究的目的是表征從新鮮發(fā)酵的乳制品（例如酸奶）中分離出的一組霉菌在三種溫度下的生長(zhǎng)潛力。通過(guò)評(píng)估霉菌與有或沒(méi)有活細(xì)胞的LAB發(fā)酵物的直接相互作用效應(yīng)，以及評(píng)估揮發(fā)物的作用的無(wú)直接接觸，來(lái)研究霉菌對(duì)不同LAB制劑的敏感性。評(píng)估選定組合中12種LAB培養(yǎng)物對(duì)這些霉菌生長(zhǎng)的抑制作用。研究錳消耗導(dǎo)致的競(jìng)爭(zhēng)排斥在抑制中的作用。
丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用
在25°C下監(jiān)測(cè)霉菌細(xì)胞生長(zhǎng)24小時(shí)。使用微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)監(jiān)測(cè)oCelloScope檢測(cè)系統(tǒng)（BioSense丹麥），這是一種新開(kāi)發(fā)的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，基于結(jié)合光學(xué)技術(shù)的獨(dú)特光學(xué)掃描技術(shù)FluidScope TM。將每個(gè)霉菌的100微升MEB培養(yǎng)基中的孢子懸浮液（1.0×103孢子/mL）添加到96孔微孔板中（大約100個(gè)孢子/孔）。接種后將96孔微孔板在室溫下靜置約1小時(shí)，讓孢子在這些孔中沉降，然后放入oCelloScope系統(tǒng)中。自動(dòng)測(cè)量樣品，并在24小時(shí)內(nèi)每60分鐘記錄一次儀器得出的生長(zhǎng)值。使用oCelloScope專(zhuān)用軟件UniExplorer(v.5.0.3)的背景校正吸收(BCA)算法{BCA=log10[Σ（校正吸收像素直方圖）]}進(jìn)行自動(dòng)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析。對(duì)于每種霉菌菌株，通過(guò)三個(gè)技術(shù)重復(fù)進(jìn)行生長(zhǎng)測(cè)試。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
乳制品非常容易受到腐敗霉菌的影響，因此表征霉菌的生長(zhǎng)潛力至關(guān)重要。毛霉菌株在MEB培養(yǎng)基和酸奶中的生長(zhǎng)速度都比青霉菌菌株快。除P.roqueforti ISI4外，所有測(cè)試的霉菌在MRS中生長(zhǎng)時(shí)均受到12種LAB菌株的強(qiáng)烈抑制。從基于MRS的發(fā)酵液中去除LAB活細(xì)胞后，抑制效果下降，單獨(dú)揮發(fā)物的效果更小，表明預(yù)形成的化合物發(fā)揮了作用，但它們不是主要的抑制因素。當(dāng)使用酸奶血清作為培養(yǎng)基時(shí)，觀察到乳酸菌生長(zhǎng)減少和霉菌生長(zhǎng)抑制較弱，而去除細(xì)胞導(dǎo)致活性幾乎完全喪失。在某些情況下，通過(guò)組合培養(yǎng)物可以增強(qiáng)抑制功效。在酸奶中，植物乳桿菌LP37造成的錳消耗在青霉菌和毛霉菌測(cè)試菌株的生長(zhǎng)抑制中發(fā)揮著重要作用。因此除了未受影響的P.roqueforti ISI4之外，這些腐敗霉菌通常對(duì)能夠使基質(zhì)中的錳無(wú)法利用的生物保護(hù)培養(yǎng)物敏感。
圖1、(A)oCelloScope監(jiān)測(cè)的13種霉菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析。數(shù)據(jù)以三個(gè)重復(fù)的平均值表示。將MEB中每種孢子懸浮液100微升(1.0×103孢子/mL)加入96孔微孔板中，一式三次，25℃孵育24 h。4株毛霉的生長(zhǎng)曲線(xiàn)為點(diǎn)線(xiàn)，9株青霉的生長(zhǎng)曲線(xiàn)為實(shí)線(xiàn)。(B)在MEB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的P.solitum ISI5(a)和M.circinelloides 01180023(B)的ocloscope圖像。比例尺:104μm。對(duì)13個(gè)霉菌在25°C下在MEB培養(yǎng)基中24小時(shí)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析（圖1A）表明，所有測(cè)試霉菌的初始接種量大致處于同一水平（100個(gè)孢子/孔），但觀察到較大差異在增長(zhǎng)潛力方面。毛霉菌株通常比青霉菌菌株生長(zhǎng)得更快，其中M.plumbeus 01180036是生長(zhǎng)最快的分離株。M.circinelloides 01180023是第一個(gè)在大約10小時(shí)后達(dá)到穩(wěn)定期的分離株，但達(dá)到的最高水平低于其他菌株。青霉屬菌株中生長(zhǎng)最快的分離株是青霉ISI3，其生長(zhǎng)速度幾乎與鉛青霉菌株一樣快。相比之下，P.roqueforti ISI4細(xì)胞相對(duì)于其他測(cè)試菌株表現(xiàn)出最慢的初始生長(zhǎng)。
圖2、(A)用含有P.roqueforti ISI4的0.5%麥芽提取物軟瓊脂覆蓋的LAB培養(yǎng)物的抗真菌抑制評(píng)分示例。對(duì)照：沒(méi)有抗真菌培養(yǎng)物的MRS瓊脂，上面覆蓋有霉菌；“+++”：強(qiáng)抑制；“++”：弱抑制；“+”：生長(zhǎng)但產(chǎn)孢延遲；“-”：無(wú)抑制。(B)板對(duì)板系統(tǒng)。L.parabuchneri LPB02（上板）產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物對(duì)MEA板（下圖）上P.commune 01180002生長(zhǎng)的抑制作用。在密閉室中，分別評(píng)估了P.commune 01180002在底部MEA板上的生長(zhǎng)情況，頂部(b)上有L.parabuchneri LPB02板的MRS發(fā)酵物，頂部(a)上有對(duì)照板。
圖3、13種霉菌在酸奶瓊脂平板上的生長(zhǎng)潛力，分別在5°C(A)、16°C(B)和25°C(C)下培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)24天。通過(guò)將每個(gè)孢子懸浮液（20μL，1.0×10 5孢子/mL）點(diǎn)樣在酸奶瓊脂平板上一式三份來(lái)確定測(cè)試。條形代表三個(gè)重復(fù)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。四種毛霉菌株用虛線(xiàn)標(biāo)記；九個(gè)青霉菌菌株，帶有實(shí)線(xiàn)。虛線(xiàn)框中（B，C）的生長(zhǎng)曲線(xiàn)被放大。
圖4、13個(gè)霉菌分別對(duì)12種含有活細(xì)胞的LAB發(fā)酵液(A)、LAB無(wú)細(xì)胞發(fā)酵液(B)以及MRS中LAB培養(yǎng)物的揮發(fā)物(C)的敏感性。LAB菌株代碼：LRH01、LRH05、LRH14、LRH16和LRH43為鼠李糖乳桿菌菌株，LP01、LP37和LP48植物乳桿菌菌株，LPC44和LPC46副干酪乳桿菌菌株，以及LPB02和LPB04 L.parabuchneri菌株。
圖5、酸奶中植物乳桿菌LP37造成的錳消耗。如所示添加不同濃度的錳（0.001、0.01和0.1 mM）。將帶有斑點(diǎn)青霉菌菌株和毛霉菌株（200個(gè)孢子/斑點(diǎn)）的平板在25°C下孵育5天。條形代表三個(gè)重復(fù)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。Bio-LP37表示培養(yǎng)物植物乳桿菌LP37。閉合符號(hào)表示青霉菌菌株；空心符號(hào)表示毛霉菌株。
總結(jié)
由于食物浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失，乳制品的真菌腐敗是一個(gè)主要問(wèn)題，一些真菌代謝物還可能對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生不利影響。乳酸菌(LAB)的使用正在成為化學(xué)防腐劑的潛在清潔標(biāo)簽替代品。本研究的目標(biāo)是表征從乳制品中分離出的一組霉菌（四種毛霉菌株和九種青霉菌菌株）在三種儲(chǔ)存溫度（5°C、16°C和25°C）下的生長(zhǎng)潛力，然后研究這些霉菌對(duì)12種培養(yǎng)基的生長(zhǎng)影響。使用Biosense微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)在25°C下監(jiān)測(cè)麥芽提取物肉湯中的真菌細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)24小時(shí)。
使用oCelloScope檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)霉菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，oCelloScope檢測(cè)系統(tǒng)是一個(gè)基于自動(dòng)光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的小型便攜式平臺(tái)。該方法可用于在三維菌絲網(wǎng)絡(luò)形成之前早期檢測(cè)生長(zhǎng)情況。還在不同溫度下孵育的酸奶瓊脂平板上進(jìn)行了生長(zhǎng)跟蹤，其中選擇5°C模擬冷藏溫度、16°C濫用冷鏈溫度和25°C室溫。oCelloScope測(cè)試和酸奶瓊脂斑點(diǎn)測(cè)試的結(jié)果非常一致。在測(cè)試的霉菌中，毛霉01180036是生長(zhǎng)最快的，而青霉菌ISI4(P.roqueforti ISI4)是生長(zhǎng)最慢的。在酸奶瓊脂平板上，所有霉菌都在5°C、16°C和25°C下以溫度依賴(lài)性方式生長(zhǎng)，無(wú)論溫度如何，毛霉菌株都比青霉菌菌株生長(zhǎng)得更快。使用高通量疊加方法測(cè)試了對(duì)12種LAB培養(yǎng)物的敏感性，其中除P.roqueforti ISI4之外的所有霉菌均受到強(qiáng)烈抑制。當(dāng)在含有LAB菌株活細(xì)胞的瓊脂平板上發(fā)現(xiàn)霉菌孢子時(shí)，這些LAB的抗真菌作用得到了證實(shí)。與酸奶血清中的單一培養(yǎng)物相比，一些LAB二元組合提高了針對(duì)多種霉菌生長(zhǎng)的抗真菌活性。對(duì)六種青霉菌和兩種毛霉菌株的可能抗真菌機(jī)制進(jìn)行了檢查，因?yàn)殄i耗盡導(dǎo)致的競(jìng)爭(zhēng)排斥作用。本研究表明，除了未抑制的P.roqueforti ISI4之外，這種機(jī)制是測(cè)試霉菌的主要抑制因素，因?yàn)樘砑渝i濃度增加至0.1 mM導(dǎo)致酸奶中霉菌生長(zhǎng)部分或完全恢復(fù)。這些發(fā)現(xiàn)有助于了解影響乳制品霉菌腐敗的參數(shù)以及污染菌株、底物和生物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物之間的相互作用。
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